Kan merkezlerinde eritrosit antijen ve antikor reaksiyonlarının gösterilmesinde RIA (Radioimmun assay) , EIA (Enzymeimmun assay) de dahil olmak üzere çok sayıda yöntem mevcuttur. Ancak, bu yöntemlerin en basit olanı aglutinasyon tekniğidir.
Elektrolitli ortamda eritrositlerin yüzeyindeki antijenler, ortamda bulunan özgül antikorlarla birleşecek olurlarsa, gözle görülebilecek kümeler oluşturarak çökerler. Bu olaya Hemaglutinasyon denir.
Zeta Potansiyel
Serum fizyolojik içerisinde süspanse edilen eritrositler, birbirlerine yaklaşık 25 nm uzaklıkta bulunurlar. Bu uzaklık, RBC yüzeyindeki negatif elektriksel yükün birbirine itmesi ile oluşur. RBC yüzeyindeki negatif yükün derecesine zeta potansiyel denir. Süspansiyon içindeki katyonlar (+ yüklü iyonlar, ör: Na+) RBC yüzeyini kuşatırlar ve RBC yüzeyindeki negatif elektriksel yük ile onu kuşatan katyonların oluşturduğu potansiyel farkı, kısaca zeta potansiyel diye nitelenebilir.
Hemaglutinasyon Sonuçlarına Etki Eden Faktörler
1. Fiziksel Koşullar
a. İnkübasyon Isısı
IgM tipi antikorlar……….. 4-27 C° (Oda ısısı)
IgG tipi antikorlar ………..30-37 C° (İnkübatör)
b. İnkübasyon Süresi
c. Santrifüj hız ve süresi
d. Ortam: pH, LISS solüsyonu, enzimler, makromoleküller
2. Eritrositler
a. Yüzey antijenlerinin sayısı, tipi, lokalizasyonu ve immunojenitesi
b. Homozigot veya heterozigot olmaları
3. Serum
a. Protein İçeriği
b. Antikorların Yapı ve Türleri
Yeni doğanlar ve yetişkinlerin antijenik reaktivitesi farklıdır. A ve B (Ayrıca P1,Lua, Lub, Yta, Xg ve Vel) antijenlerinin aktivitesi yetişkinlere göre oldukça düşüktür, ancak Rh (Ayrıca K, Fy, Jk, MNSs, Di, Do, Sc, Coa, Aua) aktivitesi, doğumda tam gelişmiştir.
Hemaglutinasyonu Kolaylaştıran Faktörler
1. Eritrositler arası mesafeyi kısaltma
a. Proteolitik enzimler: Papain, bromelin, ficin, neuraminidase, tripsin
b. Albumin: Muhtemelen RBC yüzeyindeki negatif elektrik yükü nötralize ederek etki göstermektedir.
c. Polikatyonlar: Polybrene ve protamin gibi polikatyonların eklenmesi ortamın katyon yoğunluğunu artırır ve RBC yüzeyindeki negatif yükün nötralizasyonunu sağlar.
d. LISS (Low ionic strength solution) : Ortamdaki ion sayısını azaltır.
e. Santrifüj: Santrifügasyon sırasında RBC’ler birbirlerine yaklaşırlar.
2. İki eritrosit arasında köprü oluşturma: Coombs Serumu
Yöntemler
Slide Yöntemi
Tüp Yöntemi
Jel Santrifügasyon Yöntemi
Mikroplate Yöntemi
Manual Polybrene Testi
Yarı veya Tam Otomatize Sistemler
Slide Yöntemi
ABO ve RhD antijenlerinin hızlı bir şekilde tanımlanmasında kullanılır. Eşit miktarda antiserum ile parmak ucundan alınan kan veya %20’lik eritrosit süspansiyonu lam veya fayans üzerinde çevirme hareketi ile karıştırılır. Eritrositlerin kümeler oluşturması, yani aglutinasyon oluşumu gözlenir. Tepkime yüzeyi geniş olduğundan buharlaşma fazladır. Bu sebeple 1-2 dakika (max.5 dakika) içinde değerlendirilmelidir.
Tüp Aglutinasyon Testi
Serum fizyolojikle hazırlanan eritrosit süspansiyonu ile antijen bir tüpte karıştırılır. 1000 rpm devirle 1 dakika santrifüge edildikten sonra tekrar süspanse edilir ve aglutinasyon değerlendirilir. Bu değerlendirme mikroskopla veya mercekle yapılabilir. Alternatif olarak bir damla kan lama alınarak, mikroskopla küçük büyütmede de incelenebilir. Fiziksel koşullar uygun olarak hazırlandığında, sonuçlar oldukça güvenilirdir. Buharlaşma sorunu yoktur. İstendiğinde 37 C°’de 1-2 saat inkübe edilebilir. Öte yandan RBC yıkama işlemlerinin fazla olması nedeniyle kont*****syon olasılığı diğerlerine göre daha fazladır.
Jel Santrifügasyon Yöntemi
Jel testi birçok yönden tüp yöntemine benzer. Testte 5×7 cm büyüklüğünde plastik kartlar kullanılır. Her kartın üzerinde 6 mikrotüp vardır. Mikrotüplerin tabanı, değerlendirmeyi kolaylaştırmak için konik; üst kısmı ise, inkübasyon gerektiren testler için daha geniş olarak yapılmıştır. Tüplerin içerisinde Sephadex-G 100 maddesini içeren bir jel vardır. Bu madde başlangıçta toz halindedir; ancak buffer ile karıştığında jel halini alır. Kartlar için jel hazırlanırken, önce buffer ile yıkanarak şişmesi sağlanır. Daha sonra da buffer içerisinde süspansiyonu hazırlanır. Kullanılacağı testin özelliğine göre serum fizyolojik veya LISS, buffer olarak kullanılır.
Testte zaman ve hız yönünden standardize edilmiş bir santrifüj kullanılmaktadır. Santrifügasyon işlemi, 70x’de 10 dakika yapılır. Deneysel çalışmalar, santrifüj ekseninin de önemli olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, eksen santrifüj gücü ile düşey ve yatay planda tam bir doğru oluşturmaktadır.
Buffer ile yıkama sırasında şişen jel, sadece aglutine olmayan RBC’lerin geçişine izin verir. Aglutine olmayan eritrositler, santrifüj işlemi sırasında jel tabakasını geçerek, konik kısımda çökerler. Aglutine olmuş eritrositler ise üst kısımda kümeler oluştururlar. Kuvvetli aglutinasyonda çok büyük kümeler oluşur ve jel üzerinde bir tabaka meydana getirirler. Zayıf aglutinasyonda ise küçük kümeler oluşur ve reaksiyonun şiddetini değerlendirmek de kolaylaşmış olur.
Mikroplate Yöntemi
Mikroplate yönteminde U veya V tabanlı plastik 96 godeli mikrotitrasyon plakları kullanılır. Eritrosit süspansiyonu U pleyt için %1-2’lik, V pleyt için %0,03 konsantrasyonda hazırlanır. 20 µL antiserum ve 20 µL eritrosit süspansiyonu godeye eklendikten sonra plak, santrifüge edilir. U pleytler çalkalanıp klasik teknikler gibi değerlendirilirken, V tabanlı pleytler 75 C°’de 10 dakika inkübe edildikten sonra değerlendirilir. Düşük konsantrasyonda eritrosit kullanıldığı için diğer yöntemlerden daha duyarlıdır. Çok az miktarda antiserum kullanıldığı için daha ekonomik bir metotdur.
Polybrene Yöntemi
Katyonik bir polimer olan polybrene normal eritrositlerde agregasyona neden olur. Bu agregasyon ortama sodyum sitrat eklendiğinde dağılır. Eğer eritrositler antikorlarla kaplanmış ise, polybrene eklendiğinde antikorlar, eritrositler arasında köprü oluşturarak aglutinasyona neden olur. Bu şekilde oluşan agregasyon, sodyum sitratla dağılmaz. Polybrene, hem manual hem de otomatik sistemlerde mikroplate veya tüpte kullanılabilir. Testte yapılacak ilk işlem, eritrosit yüzeyinin antikorlarla kaplanması için eritrosit süspansiyonu ile antiserumu inkübe etmektir. Daha sonra ortama polybrene eklenir. Agregasyon oluşumu izlenir. Santrifügasyon sonrası supernatant uzaklaştırılır ve ortama trisodyum sitrat-dextroz karışımı eklenerek aglutinasyon değerlendirilir.
Antiserumların Kalite Kontrolü
Kalite kontrolünde amaç, her işlemi periyodik olarak kontrol ederek organizasyon hatalarını önlemektir. Anti-A, Anti-B, ve Anti-D için günümüzde yeni standartlar oluşturulmuştur. Bu standartlar FDA standartlarıyla eşdeğerdir. Aşağıdaki tablolarda ABO ve Rh antiserumlarının kalite kontrol standartları belirtilmiştir.
ABO antiserumlarının Kalite Kontrolü
ParametreKalite GereksinimiKontrol SıklığıLaboratuarGörünümHemoliz, presipitasyon, partiküller ve jel formasyonu görülmemeliHergünGrup LabReaktivite ve Özgünlükİmmün hemoliz, rülo formasyonu veya prozone fenomeni olmamalıdır. Uygun antijenlerle kaplanmış eritrositlerle açık reaksiyona girmeli ve hatalı reaksiyon olmamalıdır.Her yeni serideGrup LabEtkinlikDilue edilmememiş serum, serum fizyolojikli test tüpünde %3′lük eritrosit süspansiyonuyla oda ısısında 3-4 pozitif reaksiyon verebilmelidir. Titrasyon, A1 ve B hücreleri ile Anti-A, Anti-B ve Anti-AB için 128; A2 ve A2B hücreleri için 64 olmalıdır.Her yeni serideGrup Lab
